La sclerosi laterale amiotrofica (SLA) è una malattia degenerativa. I neuroni responsabili del movimento iniziano a morire e il controllo muscolare viene progressivamente perso, portando ad un esito fatale. Le cause della SLA sono attualmente sconosciute e non esiste un trattamento efficace.
In un articolo pubblicato su Molecular Cell, un team guidato da Óscar Fernández-Capetillo, capo del Gruppo di Instabilità Genomica presso il Centro nazionale spagnolo per la ricerca sul cancro (CNIO), fornisce la prima prova che una possibile causa della forma ereditaria di SLA: quella familiare.
La SLA e l’accumulo nei motoneuroni di “proteine spazzatura”
La sclerosi laterale amiotrofica è l’accumulo nei motoneuroni di “proteine spazzatura”, proteine prive di funzione che si accumulano in modo errato e impediscono il corretto funzionamento della cellula.
Nello specifico, queste proteine non funzionali che si accumulano sono proteine ribosomiali, che normalmente formano i ribosomi, fabbriche molecolari incaricate della produzione delle proteine.
Questo studio fornisce quindi una nuova ipotesi per comprendere l’origine della sclerosi laterale amiotrofica, suggerendo che abbia un’origine simile a un altro gruppo di malattie rare note come ribosomopatie, anch’esse associate ad un eccesso di proteine ribosomiali non funzionali (nel caso della sclerosi laterale amiotrofica, questo problema è limitato ai motoneuroni).
Il nuovo studio apre anche un nuovo fronte in un ambito diverso, quello della ricerca sull’invecchiamento. Gli autori propongono un nuovo fattore causale nel processo di invecchiamento , che fino ad ora sarebbe stato trascurato: lo stress nucleolare, un meccanismo mediante il quale gli organelli chiamati nucleoli reagiscono a vari danni nella cellula.
“Nel nostro lavoro riportiamo un nuovo modello che spiega come lo stress nucleolare induce tossicità nelle cellule animali e forniamo prove dirette che accelera l’invecchiamento nei mammiferi”, afferma Vanesa Lafarga, coautrice dello studio.
La maggior parte dei pazienti affetti da SLA ereditaria condivide mutazioni in un gene chiamato C9ORF72. Questa mutazione provoca la produzione di proteine tossiche, o peptidi, ricchi dell’amminoacido arginina. In un lavoro precedente, il gruppo di Fernandez Capetillo ha mosso i primi passi per capire perché questi peptidi sono tossici. Il motivo è che queste tossine si attaccano al DNA e all’RNA “come se fossero catrame”, influenzando praticamente tutte le reazioni della cellula che utilizzano questi acidi nucleici.
Lo studio pubblicato su Molecular Cell , di cui Oleksandra Sirozh è la prima autrice, mostra che la tossina ha un effetto particolarmente acuto sulla produzione di nuovi ribosomi, fabbriche di produzione all’interno della cellula, costituiti da RNA e proteine.
Pertanto, poiché non riescono a completare il loro assemblaggio, “la cellula accumula un eccesso di proteine ribosomiali orfane, incapaci di formare ribosomi”, spiega Fernández Capetillo. “Queste proteine finiscono per far collassare i sistemi di pulizia cellulare, il che porta infine alla morte dei motoneuroni.”
Per gli autori, questo lavoro suggerisce per la prima volta una somiglianza tra la causa della SLA e un altro tipo di malattie note come ribosomopatie, anch’esse associate all’accumulo di proteine ribosomiali disfunzionali in modo generalizzato in tutte le cellule del corpo umano.
Sulla base di questa constatazione, il gruppo CNIO ha esplorato una soluzione. “Poiché il problema è l’eccesso di spazzatura ribosomiale, abbiamo esplorato strategie per far sì che le cellule producano meno ribosomi”, spiega Fernández-Capetillo. Per raggiungere questo obiettivo, hanno utilizzato la manipolazione genetica e farmacologica per disattivare due dei meccanismi che generano ribosomi nei tessuti in vitro, e hanno scoperto che, producendo meno “spazzatura”, la tossicità viene effettivamente ridotta.
Tuttavia, Fernández-Capetillo afferma che questi risultati dovrebbero essere interpretati con cautela. “Siamo ai primi passi per vedere se possiamo dare un angolo terapeutico a questi risultati.” Per il momento questi esperimenti indicano semplicemente “la possibile esistenza di strade che non erano state esplorate nella ricerca di cure” contro la SLA.
“Dobbiamo trovare il modo di ridurre la produzione di ribosomi in modo che i rifiuti diminuiscano, pur mantenendone un numero sufficiente a garantire il corretto funzionamento delle cellule.”
Il nucleolo è la componente cellulare in cui vengono sintetizzati i ribosomi. Negli ultimi decenni si è osservato che una delle sue funzioni è anche quella di individuare situazioni di stress nella cellula, come danni al DNA o mancanza di nutrienti. Lo stress nucleolare può eventualmente alterare la produzione di proteine e i suoi fattori scatenanti sono oggetto di un’area di ricerca molto attiva.
Nel lavoro pubblicato gli autori hanno generato animali che esprimevano in tutto il corpo la tossina trovata nei pazienti affetti da SLA, che induceva un grave stress nucleolare. Ma i ricercatori hanno anche osservato, inaspettatamente, che questi animali invecchiavano molto rapidamente.
Sulla base dei loro studi precedenti, hanno scoperto che questo invecchiamento era dovuto anche all’accumulo di proteine ribosomiali non funzionali: quando agli animali veniva somministrato un farmaco che riduce il tasso di produzione dei ribosomi, la loro aspettativa di vita raddoppiava.
Si era speculato sulla relazione tra stress nucleolare e invecchiamento, ma non era stato possibile dimostrare una relazione causale. Questo lavoro “è la prima prova sperimentale che la generazione di stress nucleolare accelera l’invecchiamento”, afferma Fernández Capetillo.
La causa della morte neuronale nei pazienti affetti da SLA familiare
È noto che nel 10% degli individui affetti da SLA esiste una forte componente genetica che fa sì che la malattia si manifesti in più membri di una stessa famiglia. In circa la metà di questi casi di SLA familiare, l’origine risiede in un gene chiamato C9ORF72. Ma perché le mutazioni in questo gene uccidono i motoneuroni?
Il gruppo di instabilità genomica guidato da Óscar Fernández-Capetillo presso il Centro nazionale spagnolo di ricerca sul cancro (CNIO) ha ora scoperto un meccanismo che spiega la tossicità derivata dalle mutazioni in C9ORF72. Il nuovo meccanismo collega queste mutazioni a un problema generale che blocca tutti gli acidi nucleici , DNA e RNA, e quindi interrompe una moltitudine di processi fondamentali per il funzionamento delle cellule.
I ricercatori della SLA avevano già osservato che molti processi cellulari di base che utilizzano gli acidi nucleici falliscono nei neuroni dei pazienti affetti. Ora il gruppo CNIO fornisce un modello che li collega tutti e spiega questi problemi diffusi.
“Penso che abbiamo un modello abbastanza soddisfacente che ci aiuta a capire cosa sta succedendo nei motoneuroni dei pazienti affetti da SLA, cosa li sta uccidendo”, dice Fernández-Capetillo. “Siamo entusiasti, perché la chiave per curare qualsiasi malattia è capire prima cosa non funziona. Solo allora si può iniziare a cercare un trattamento.”
Sebbene il meccanismo appena identificato sia associato a mutazioni in un gene specifico, C9ORF72, il gruppo CNIO ritiene probabile che altre mutazioni correlate alla SLA agiscano in modo simile, cioè bloccando il DNA e l’RNA dei motoneuroni.
Le mutazioni del gene C9ORF72 sono tossiche, rivelano i ricercatori del CNIO, perché inducono la cellula a produrre piccole proteine o peptidi molto ricchi di arginina, un amminoacido che , per la sua carica positiva e la sua natura chimica, si lega molto avidamente alle cellule nucleiche acidi, DNA e RNA.
Lo studio del CNIO indica che, legandosi agli acidi nucleici con un’affinità così elevata, queste proteine ricche di arginina spiazzano tutte le proteine cellulari che interagiscono con DNA e RNA in modo diffuso, bloccando così qualsiasi reazione cellulare che coinvolga DNA o RNA. E di conseguenza, con i suoi acidi nucleici effettivamente bloccati, la cellula muore.
Il DNA contiene le istruzioni affinché la cellula possa produrre le proteine di cui ha bisogno per il corretto funzionamento. Centinaia di proteine devono ancorarsi al DNA e all’RNA per leggere le loro istruzioni ed eventualmente creare nuovi componenti per la cellula. Ma “la presenza di peptidi ricchi di arginina ostacola qualsiasi reazione che coinvolga gli acidi nucleici”, aggiungono gli autori del nuovo studio.
Fernández-Capetillo afferma: “Quello che abbiamo visto è che i peptidi contenenti arginina sono come una specie di catrame che si attacca agli acidi nucleici e li decora, e così facendo spostano le proteine che sono normalmente legate agli acidi nucleici in modo che niente che coinvolga DNA o RNA funziona.”
“In tutti questi decenni di ricerca sulla SLA, i ricercatori di neuroscienze hanno pubblicato ogni sorta di problemi nelle reazioni che utilizzano gli acidi nucleici: traduzione, replicazione, ecc. Niente funziona! Pensiamo che il nostro modello dia una risposta semplice a tutte queste osservazioni”, continua Fernández- Capetillo.
La ricerca di Fernández-Capetillo si concentra solitamente sul cancro, ma si sforza di tenere gli occhi aperti su qualsiasi problema a cui si possano applicare le sue conoscenze. Nel 2014 ha iniziato a lavorare sulla SLA, convinto che una tecnica recentemente messa a punto nel suo gruppo potesse aiutarli a comprendere la tossicità delle mutazioni nel gene C9ORF72. Ed è stato un lampo di intuizione, un’idea venuta dopo aver preso un caffè al CNIO con il premio Nobel Jack Szostak, a metterlo sulle tracce dell’arginina.
“Szostak studia la chimica dell’origine della vita e mi ha detto che per fermare le reazioni che coinvolgono gli acidi nucleici, quello che hanno usato nei loro esperimenti erano peptidi sintetici con molta arginina a causa della loro elevata affinità per gli acidi nucleici,” dice Fernández-Capetillo . “Così ho pensato, e se questo fosse ciò che sta succedendo, e se le proteine ricche di arginina nei pazienti affetti da SLA bloccassero il DNA e l’RNA in modo generalizzato?”
Szostak studia la chimica dell’origine della vita e mi ha detto che per fermare le reazioni che coinvolgono gli acidi nucleici, quello che hanno usato nei loro esperimenti erano peptidi sintetici con molta arginina a causa della loro elevata affinità per gli acidi nucleici,” dice Fernández-Capetillo . “Così ho pensato, e se questo fosse ciò che sta succedendo, e se le proteine ricche di arginina nei pazienti affetti da SLA bloccassero il DNA e l’RNA in modo generalizzato?”
Questa ipotesi iniziale è stata supportata quando il gruppo ha deciso di verificare se problemi simili si riscontrassero anche quando le cellule fossero esposte a una proteina naturale che contiene molte arginine. Esiste una proteina simile, ma viene espressa solo transitoriamente durante lo sviluppo degli spermatozoi: la protamina.
Coerentemente con il modello ora pubblicato su The EMBO Journal , la funzione biologica della protamina è quella di spostare gli istoni dal DNA; gli istoni sono proteine che facilitano la compattazione del DNA. “Scambiando gli istoni con la protamina, che è più piccola, il DNA degli spermatozoi può diventare più compatto”, spiega Fernández-Capetillo.
Tuttavia, la protamina è tossica per qualsiasi cellula che non sia una cellula spermatica. “Pensiamo che ciò che accade nei pazienti affetti da SLA è equivalente a ciò che accadrebbe se i loro motoneuroni iniziassero accidentalmente a produrre protamina.”
Ora che il gruppo ha determinato perché i peptidi ricchi di arginina sono tossici, il passo successivo è trovare modi per superare questa tossicità. E nel gruppo le ricerche in questa direzione sono già iniziate. Così come il lavoro per creare modelli animali in cui viene riprodotto il problema, la produzione di peptidi tossici, per fornire una piattaforma per testare potenziali terapie.
Imparare come alleviare la tossicità di questi peptidi può essere utile anche per affrontare la SLA non associata a C9ORF72, cioè la malattia nel suo insieme. Gli autori dell’articolo ritengono che il diffuso meccanismo di blocco degli acidi nucleici sia probabilmente ciò che accade nella SLA in generale.
Vanesa Lafarga afferma: “La stragrande maggioranza delle mutazioni riscontrate nei pazienti affetti da SLA riguardano proteine che legano l’RNA, e ciò che queste mutazioni generalmente fanno è impedire il legame di queste proteine con l’RNA. Inoltre, le cellule di questi pazienti hanno anche problemi molto generali con loro acidi nucleici.
Ecco perché crediamo che, sebbene le mutazioni in C9ORF72 colpiscano solo una frazione di pazienti con SLA, il meccanismo alla base della tossicità dei neuroni potrebbe non essere fondamentalmente diverso da quello che accade nel resto dei pazienti con SLA. è questo il caso è qualcosa su cui stiamo lavorando adesso”.
Come i motoneuroni nel cervello muoiono durante la SLA
Circa il 5% dei pazienti affetti da SLA è portatore di una versione alterata di un gene chiamato C9orf72, che nei pazienti affetti da sclerosi laterale amiotrofica contiene centinaia di sequenze ripetute che altrimenti non sarebbero presenti negli individui normali. Dalla scoperta del gene nel 2011, tuttavia, i ricercatori hanno cercato di comprendere la sua normale funzione e il suo ruolo nella sclerosi laterale amiotrofica , proponendo molteplici ipotesi.
L’autore senior Davide Trotti, Ph.D., co-direttore dell’Unità Weinberg per la ricerca sulla SLA presso la Thomas Jefferson University, ha esplorato tre ipotesi principali. La prima idea, che la mutazione C9orf72 nella sclerosi laterale amiotrofica interrompe la normale funzione del gene nella cellula, non ha resistito.
Quando i ricercatori hanno bloccato l’espressione del gene, riducendo la quantità di proteina prodotta, i neuroni hanno continuato a comportarsi normalmente, suggerendo che il gene C9orf72 non è essenziale per la salute neuronale.
L’altra possibilità era che le sequenze ripetute contenute in questo gene generassero un prodotto – RNA o proteina – che è tossico per la cellula. L’RNA trascritto dal gene C9orf72 è piegato in una forma insolita chiamata quartetto G, simile a una pila di piastre, che potrebbe aver interferito con le normali funzioni cellulari. Una terza opzione era che le proteine generate in modo anomalo da queste grandi sequenze ripetute nel gene C9orf72 dei pazienti affetti da SLA fossero in qualche modo tossiche per i neuroni.
Il dottor Trotti e colleghi hanno generato una versione sintetica dei quartetti G di RNA e li hanno inseriti in cellule sane che non contenevano la mutazione C9orf72.
I neuroni che avevano versioni più lunghe dei quartetti (più piastre nella pila) avevano due volte maggiori probabilità di morire rispetto a quelli con meno quartetti G, suggerendo che questo meccanismo potrebbe svolgere un ruolo.
La prova più convincente è arrivata quando il dottor Trotti e colleghi hanno testato le proteine create dall’RNA C9orf72. Sebbene dalla stessa sequenza di RNA potessero essere generate cinque proteine distinte, i ricercatori hanno scoperto che una delle cinque causava il maggior danno alla cellula.
La catena proteica costituita da ripetizioni degli aminoacidi prolina (P) e arginina (R), chiamata catena poli-PR, si accumula nel nucleolo e uccide molto rapidamente il neurone che la produce.
Monitorando il destino di un neurone vivente in tempo reale, i ricercatori hanno potuto vedere che man mano che più proteina PR si accumulava nel nucleolo, la cellula diventava più gonfia e poi improvvisamente moriva. La reazione è stata rapida e si è verificata entro 72 ore.
Per verificare se i processi osservati nelle cellule fossero veri negli esseri umani, i ricercatori hanno testato cellule iPS derivate da motoneuroni di pazienti affetti da SLA che avevano la mutazione C9orf72A per le catene della proteina PR. In effetti, i motoneuroni ospitavano la proteina tossica PR. Inoltre, quando sia le catene di RNA che le proteine PR erano attive nella cellula, i ricercatori hanno osservato un effetto sinergico, suggerendo che entrambi i meccanismi potrebbero essere coinvolti nel causare il danno ai motoneuroni.
“Questi studi suggeriscono che se potessimo prevenire la formazione di aggregati PR o promuoverne la disgregazione, potremmo aiutare a prevenire il danno ai motoneuroni che causa i sintomi che vediamo nei pazienti affetti da SLA”, afferma il Dott. Trotti.