Malattia di Huntington: nuova tecnica per rivelare le ripetizioni genetiche

Le malattie neurodegenerative sono tra le malattie umane più complesse e le loro cause e meccanismi esatti sono oggetto di ricerca e dibattito in corso. Per quanto riguarda la malattia di Huntington, le prove accumulatesi costantemente negli ultimi 30 anni hanno portato a un modello di eventi molecolari che spiega diverse caratteristiche chiave della malattia, compreso il motivo per cui ha un esordio precoce in alcune persone e perché causa sintomi come la malattia involontaria movimenti e sbalzi d’umore.

Due nuovi documenti complementari della Rockefeller University suggeriscono che questa potrebbe non essere tutta la storia.

La malattia di Huntington è causata da espansioni CAG somatiche in cui una ripetizione di triplette di basi di DNA in un gene mutato dell’huntingtina (mHTT) aumenta di numero nel corso della vita, portando alla morte cellulare. gli scienziati Rockefeller hanno utilizzato una tecnica personalizzata per rivelare che queste ripetizioni genetiche sono instabili e probabilmente producono proteine più tossiche, solo in tipi selezionati di cellule cerebrali . Inoltre, alcune cellule studiate si sono rivelate sorprendentemente resistenti all’espansione delle ripetizioni CAG.

I risultati degli studi sono stati pubblicati cati su Nature Genetics e su Neuron.

Malattia di Huntington: ecco cosa hanno rivelato le nuove scoperte

I risultati mettono in luce le sfumature cellulari di una condizione ancora misteriosa e forniscono potenziali bersagli per interventi terapeutici futuri.

“Quello che non ci aspettavamo era di vedere che le cellule che trasportano lunghe ripetizioni CAG possono sopravvivere”, afferma Nathaniel Heintz, capo del Laboratorio di Biologia Molecolare del Rockefeller. “Questo è molto sorprendente. Se l’espansione non è sufficiente per la morte, cos’altro è necessario?”

Nell’mHTT, le basi ripetute del DNA – citosina, adenina e guanina – formano tratti lunghi e instabili, risultanti in proteine mutanti che causano danni ad alcune cellule neurali.

Il numero di ripetizioni CAG corrisponde strettamente al rischio di malattia: , di solito tra i 30 e i 50 anni. Più lunghi sono i segmenti CAG, più precoce è la comparsa dei sintomi. Man mano che la neurodegenerazione si espande, la malattia diventa fatale, perché mancano trattamenti che rallentino o impediscano l’espansione somatica e l’accumulo dell’huntingtina mutata.

I processi molecolari alla base dell’espansione CAG e della morte cellulare non sono compresi. Nel corso dei decenni, il laboratorio Heintz ha generato dati trascrizionali ed epigenetici approfonditi e ad alta risoluzione sul cervello dei mammiferi che, tra le altre cose, hanno portato alla scoperta di nuove interessanti modifiche al genoma neuronale che potrebbero svolgere un ruolo critico nell’invecchiamento cerebrale e degenerazione. Più recentemente, il team ha deciso di applicare approcci simili allo studio della malattia di Huntington.

“La generazione di dati di alta qualità da campioni post-mortem nelle fasi iniziali della malattia può darci informazioni su ciò che predispone alcuni tipi di cellule a soccombere”, afferma Heintz.

Per fare ciò, Kert Mätlik, ricercatore associato nel laboratorio di Heintz e primo autore dell’articolo su Nature Genetics , ha adattato un metodo di analisi cellulare chiamato FANS (smistamento nucleare attivato dalla fluorescenza) per profilare molecolarmente cellule specifiche nello striato, una regione del profondo cervello collegato al controllo motorio e alla cognizione che è fortemente influenzato dalla malattia di Huntington e dal morbo di Parkinson.

Analizzando le cellule striatali di persone morte di Huntington e che hanno donato il loro cervello alla scienza, Mätlik ha scoperto che i segmenti ripetuti erano particolarmente instabili nei neuroni spinosi medi (MSN), i neuroni striatali più comuni. Queste sono anche le cellule che notoriamente vengono perse dallo striato durante la progressione della malattia di Huntington.

Mätlik ha notato che i livelli di due proteine di riparazione del DNA MSH2 e MSH3, che formano il complesso MutSβ, erano particolarmente alti negli MSN. Durante la divisione cellulare, il compito di queste proteine è quello di avviare la riparazione dei filamenti di DNA non corrispondenti, stabilizzando così il genoma prevenendo mutazioni che potrebbero altrimenti portare al cancro.

Quando si tratta di ripetizioni CAG, queste proteine sembrano promuovere l’espansione CAG anziché prevenirla. “I loro livelli elevati potrebbero davvero rendere un disservizio a questi neuroni”, afferma Mätlik.

Sebbene la resilienza della maggior parte degli altri tipi di cellule striatali possa essere spiegata dalla stabilità delle ripetizioni CAG in essi contenute, Mätlik è stato sorpreso di scoprire che non tutte le cellule con espansioni CAG vengono colpite allo stesso modo. “Ciò ci ha portato a credere che, sebbene l’espansione CAG sia un primo passo fondamentale nella patogenesi della malattia di Huntington, non causa la morte cellulare in tutti i casi. Qualche altro processo gioca un ruolo”, afferma Mätlik.

Nel secondo studio, pubblicato su Neuron , la prima autrice Christina Pressl, istruttrice di indagini cliniche al Rockefeller, ha sviluppato il metodo sFANS (smistamento nucleare attivato dalla fluorescenza seriale) per isolare diversi tipi di cellule in cinque regioni della corteccia: il motore, il cingolo , corteccia visiva, insulare e prefrontale, in 13 cervelli MH in stadio iniziale.

La corteccia è composta da sei strati, ciascuno numerato in base alla sua profondità; numeri più alti equivalgono a strati più profondi. La maggior parte delle sue cellule sono neuroni piramidali, che utilizzano i dendriti per ricevere input sinaptici e gli assoni per inviare potenziali d’azione, principalmente ad altre parti del cervello. Alcune di queste trasmissioni arrivano fino al midollo spinale.

Pressl ha utilizzato sFANS e profilazione molecolare profonda per identificare 16 tipi di cellule. “Abbiamo immediatamente visto un insieme specifico di cellule che era gravemente disturbato”, dice.

Nella regione motoria della corteccia, le cellule piramidali negli strati cinque e sei avevano ripetizioni CAG drammaticamente lunghe rispetto a tutti gli altri tipi di cellule corticali. Utilizzando sFANS seguiti dal sequenziamento dell’RNA di una singola cellula, i ricercatori hanno dimostrato che solo le cellule dello strato 5A avevano maggiori probabilità di morire.

Con questa scoperta, “abbiamo messo sulla mappa un altro tipo di cellula che aumenta la vulnerabilità alla malattia di Huntington”, osserva Pressl.

Il motivo per cui le celle 5A fossero le meno resistenti, tuttavia, “è davvero sconcertante”, afferma. Una potenziale ragione è che si proiettano allo striato ed è stato dimostrato che la connettività tra queste regioni vacilla nella malattia di Huntington. “Forse le cellule vulnerabili 5A presenti nella corteccia sono collegate alle cellule MSN vulnerabili presenti nello striato”, afferma Pressl. “Quando si tratta di Huntington, l’intera rete neurale ad un certo punto si rompe.”

Il team di Heintz perseguirà molteplici linee di indagine a partire da questi risultati. Mätlik cercherà di comprendere più chiaramente come il complesso MutSβ danneggia anziché guarire nei MSN. “I nostri risultati hanno contribuito all’interesse che queste proteine hanno suscitato come potenziali bersagli per l’intervento terapeutico per la malattia di Huntington”, osserva Mätlik.

Pressl studierà la corteccia, che è in gran parte inesplorata nelle malattie neurodegenerative : “Sono molto entusiasta di applicare le nostre strategie a molteplici regioni corticali del cervello dell’Alzheimer”, afferma.

Per Heintz rimangono le domande fondamentali sulla malattia. “Esiste una lunghezza specifica di ripetizioni alla quale le cellule diventano disfunzionali?” lui chiede. “Se una cellula si ripete ma non muore, è abbastanza disfunzionale da causare sintomi? A quale lunghezza di ripetizione CAG muoiono le cellule e differisce a seconda del tipo di cellula? Dobbiamo capire queste cose per svilupparne di nuove trattamenti per questa malattia devastante.”

La malattia di Huntington provoca movimenti involontari e demenza, non ha cura ed è fatale. Per la prima volta, gli scienziati della UC Riverside hanno dimostrato di poter rallentare la sua progressione nelle mosche e nei vermi, aprendo la porta ai trattamenti umani.

La chiave per comprendere questi progressi è il modo in cui l’informazione genetica nelle cellule viene convertita dal DNA all’RNA e quindi alle proteine. Il DNA è composto da sostanze chimiche chiamate nucleotidi: adenina (A), timina (T), guanina (G) e citosina (C). L’ordine di questi nucleotidi determina quali istruzioni biologiche sono contenute in un filamento di DNA.

A volte, alcuni nucleotidi del DNA si ripetono, espandendo il filamento di DNA. Nella malattia di Huntington, questa espansione avviene con tre nucleotidi, citosina-adenina-guanina o CAG.

L’espansione in un numero straordinario di sequenze CAG ripetute di DNA è associata ad un’esordio precoce e ad una maggiore gravità dei sintomi della malattia di Huntington. Osservazioni simili sono state fatte per una serie di altre malattie neurodegenerative.

C’è un effetto collaterale insidioso quando queste ripetizioni del DNA vengono tradotte in RNA. La cellula modifica chimicamente l’accumulo extra di RNA. Wang e i suoi collaboratori hanno appreso che l’RNA modificato svolge un ruolo cruciale nella neurodegenerazione.

“Siamo i primi a scoprire che un tipo di modificazione chimica, chiamata metilazione, si verifica più frequentemente con ripetizioni extra nell’RNA. Quindi vediamo una distribuzione anormale e un accumulo di una particolare proteina nelle cellule”, ha affermato Yinsheng Wang, illustre professore di chimica dell’UCR. “In altre parole, la metilazione converte un’importante proteina cellulare in rifiuti.”

Questi risultati sono paralleli alle osservazioni effettuate per la stessa proteina nei tessuti cerebrali dei pazienti con malattia di Huntington, SLA e demenza frontotemporale. Ripetizioni di RNA più lunghe significano un tasso di modificazione più elevato, che genera più rifiuti proteici ed esacerba la malattia.

“Anche le persone sane hanno fino a 34 ripetizioni CAG su un particolare gene, il gene HTT”, ha detto Wang. “Tuttavia, a causa di cause ambientali o genetiche, potrebbero esserci fino a 100 ripetizioni CAG nelle cellule delle persone con la malattia di Huntington.”

Sequenze di RNA lunghe e ripetitive possono trasformarsi in un eccesso di proteine nelle cellule, creando “spazzatura cellulare” che ha effetti tossici.

Un nuovo articolo della rivista Nature descrive in dettaglio come la metilazione dell’RNA sulle ripetizioni CAG sia implicata nel complesso meccanismo alla base della malattia di Huntington. L’articolo spiega anche come i ricercatori hanno ridotto notevolmente la progressione della malattia nei vermi e nei moscerini della frutta e hanno prolungato la durata della vita delle mosche introducendo una proteina nelle cellule che rimuove la metilazione.

Al momento non esiste alcun modo per curare o addirittura rallentare la progressione della malattia di Huntington. Gli operatori sanitari in genere offrono farmaci per alleviare alcuni sintomi. Sebbene questa svolta non sia una cura, rappresenta la possibilità di una terapia efficace laddove attualmente non esiste.

Il gruppo di ricerca, che comprende i professori Weifeng Gu dell’UCR, X. William Yang dell’UCLA e Nancy M. Bonini dell’Università della Pennsylvania, sta ora cercando piccole molecole che possano inibire la metilazione e costituire la base della terapia per l’Huntington.

Poiché le ripetizioni dell’RNA sono presenti in malattie simili, come la SLA e alcuni tipi di atassia spinocerebellare, la porta è aperta ai trattamenti per queste altre malattie degenerative fatali.

“Non pensiamo che i meccanismi che abbiamo studiato siano gli unici che contribuiscono alla malattia di Huntington”, ha detto Wang. “Tuttavia, abbiamo dimostrato che prendendo di mira questi fenomeni possiamo ridurre la malattia negli organismi modello, il che potrebbe portare a vite migliori e più lunghe per coloro che soffrono di questa e potenzialmente anche di altre malattie.”

I ricercatori guidati da D. James Surmeier, Ph.D., professore di Nathan Smith Davis e presidente di Neuroscienze, hanno scoperto circuiti neuronali precedentemente sconosciuti che contribuiscono alla disfunzione cerebrale nella malattia di Huntington.

Lo studio, pubblicato su Nature Communications , fa luce su nuovi meccanismi circuitali che potrebbero servire come potenziali bersagli terapeutici per il trattamento dei pazienti affetti da Huntington.

La malattia di Huntington è una malattia neurodegenerativa ereditaria e progressiva. I sintomi comuni della malattia di Huntington includono movimenti involontari, ipercinetici e interruzioni del funzionamento comportamentale, emotivo e cognitivo. I sintomi della malattia legati al movimento sono causati dalla disfunzione dei neuroni nello striato, una regione sottocorticale del cervello coinvolta nella formazione delle abitudini, nell’azione diretta a uno scopo e nel movimento volontario.

A livello molecolare , i pazienti affetti dalla malattia di Huntington presentano un numero maggiore di ripetizioni della sequenza CAG (citosina, adenina, guanina) nel gene dell’huntingtina. Sebbene sia noto da tempo che l’espansione della CAG nell’huntingtina causa la malattia di Huntington, il modo preciso in cui la proteina mutante dell’huntingtina interrompe la funzione neuronale è rimasto irrisolto.

Nel presente studio, il team di Surmeier ha utilizzato un modello murino maschio di Huntington e un’interrogazione optogenetica dei circuiti striatali per contribuire a colmare questa lacuna. Hanno scoperto che gli input sinaptici ai principali neuroni striatali erano significativamente alterati dall’huntingtina mutante.

Nello specifico, i principali neuroni striatali ricevono informazioni da due diversi tipi di neuroni corticali: un input dai neuroni del tratto piramidale e l’altro dai neuroni intratelencefalici. Nel modello murino di Huntington, i ricercatori hanno scoperto che il percorso intratelencefalico creava connessioni più forti rispetto ai topi normali, mentre quelle del tratto piramidale erano più deboli.

Questa distorsione delle informazioni ricevute dai principali neuroni striatali è stata causata da un deficit nel rilascio di acetilcolina da parte degli interneuroni colinergici striatali, che sono fondamentali per la flessibilità comportamentale o per il cambiamento del comportamento in risposta a determinati risultati.

“Quando gli interneuroni colinergici diventano disfunzionali, i circuiti striatali hanno difficoltà ad adattarsi alle nuove circostanze. In effetti, questa è una delle caratteristiche chiave dei pazienti con malattia di Huntington: hanno difficoltà a cambiare il loro comportamento quando cambiano le contingenze”, ha detto Surmeier.

Successivamente, i ricercatori hanno utilizzato un virus adeno-associato che trasportava una proteina repressore zinc finger per sopprimere selettivamente l’huntingtina mutante. Utilizzando questa tecnica, i ricercatori hanno potuto sopprimere selettivamente il gene mutato dell’huntingtina negli interneuroni colinergici striatali e, così facendo, normalizzare la connettività intratelencefalica.

“Poiché l’huntingtina mutante è ampiamente espressa, il fatto che riducendola selettivamente solo negli interneuroni colinergici abbia avuto un effetto così profondo sulla connettività striatale è stato sorprendente. Questo studio indica chiaramente il potenziale valore terapeutico delle proteine zinc finger”, ha detto Surmeier.

Per quanto riguarda i prossimi passi, Surmeier ha detto che il suo team sta studiando come gli interneuroni colinergici striatali influiscono su altri aspetti dei circuiti striatali e come potrebbero influenzare il movimento involontario nei pazienti con malattia di Huntington.

“I neuroni striatali che sono particolarmente vulnerabili nella malattia di Huntington sono coinvolti nell’inibizione di azioni indesiderate”, ha detto Surmeier. “Stiamo ora cercando di capire come gli interneuroni colinergici influenzano quelle cellule e come sono coinvolti nel normale controllo del movimento.”