Uno studio ha identificato una mutazione genetica alla base di una rara forma di epilessia e rivela nuovi meccanismi molecolari e cellulari attraverso i quali il disturbo si manifesta nei pazienti.
La ricerca è stata pubblicata oggi come prestampa rivista in eLife.
Encefalopatia KCNQ2: una rara forma di epilessia
La ricerca è stata descritta come di fondamentale importanza in quanto fa avanzare sostanzialmente la nostra comprensione dell’encefalopatia KCNQ2. Descrivono i metodi utilizzati come lo stato dell’arte, fornendo una forza di prova convincente.
“L’encefalopatia KCNQ2 è un raro disturbo dello sviluppo neurologico causato da varianti del gene KCNQ2, che fornisce la ricetta per un tipo di canale del potassio nel cervello”, spiega l’autore principale Timothy Abreo, uno studente del Genetics and Genomics Graduate Program presso il Baylor College of Medicine, Houston, Texas, Stati Uniti.
“Il disturbo di solito si manifesta con convulsioni che iniziano entro pochi giorni dalla nascita e ritardi nello sviluppo che durano tutta la vita e senza un trattamento attuale efficace.”
Le varianti recentemente identificate nel gene KCNQ2 sono difficili da valutare, perché non tutte le varianti causano malattie e le ragioni per cui alcune varianti portano alla malattia sono state scarsamente comprese.
Lo studio del gruppo di ricerca è iniziato quando una bambina, nata negli Stati Uniti, ha avuto attacchi epilettici ricorrenti durante il primo mese di vita.
I test genetici hanno rivelato un singolo cambiamento di aminoacidi – la glicina 256 cambiata in triptofano (G256W) – su una copia del gene KCNQ2, che era precedentemente sconosciuto e classificato come di significato clinico incerto.
Lo studio del team ha caratterizzato attentamente la storia clinica e di sviluppo del giovane paziente. Durante l’infanzia, i ritardi dello sviluppo divennero evidenti e successivamente le fu diagnosticato un deficit visivo corticale e un disturbo dello spettro autistico. Ora ha 12 anni ed è in grado di utilizzare un dispositivo di comunicazione adattivo per fare richieste e utilizzare il linguaggio dei segni modificato.
I ricercatori hanno seguito la letteratura scientifica e successivamente hanno trovato altri tre individui in Asia e nell’UE con la stessa variante G256W e sintomi simili al paziente statunitense.
Questa componente di studio osservazionale ha permesso al team di specificare le caratteristiche da modellare in laboratorio.
Il team ha esaminato la struttura e la patogenicità della variante G256W utilizzando approcci molecolari, cellulari e in vivo. Hanno modellato le conseguenze strutturali della variante G256W sulla base delle strutture riportate al microscopio crioelettronico del canale KCNQ2 e di altre proteine canale simili.
Come altri canali del potassio, KCNQ2 contiene tre regioni critiche: la torretta, l’elica dei pori e il filtro di selettività. Le varianti che causano malattie tendono a trovarsi nei residui vicino al filtro di selettività, a causa del suo ruolo cruciale nel consentire il flusso degli ioni.
L’amminoacido G256 si trova relativamente lontano dal filtro di selettività, il che indicherebbe tipicamente che una variante potrebbe avere meno probabilità di causare malattie.
Il team ha scoperto prove che il G256 aiuta a formare una rete di legami idrogeno che servono a stabilizzare la struttura della regione di formazione dei pori. Ciò ha fornito una nuova ipotesi sul motivo per cui una mutazione di amminoacidi così distante dal filtro di selettività potrebbe essere patogena.
Successivamente, Abreo e colleghi hanno condotto una serie di esperimenti in cui hanno introdotto la variante G256W nelle cellule insieme ai normali geni KCNQ2 e KCNQ3. Hanno misurato l’attività elettrica nelle cellule e hanno osservato che la presenza della variante G256W sopprimeva la funzione del gene normale e riduceva la corrente ionica generata dalle cellule.
Infine, hanno utilizzato tecniche di editing genetico Crispr/Cas9 e hanno generato topi portatori della stessa variante G256W.
I topi con G256W hanno mostrato alterazioni nella distribuzione delle proteine KCNQ2 e KCNQ3 all’interno del cervello, in particolare in una regione chiamata ippocampo che svolge un ruolo essenziale nell’apprendimento e nella memoria.
Hanno scoperto che nei modelli murini, le proteine KCNQ2 e KCNQ3 venivano spostate dalla loro posizione abituale nei segmenti iniziali degli assoni ai corpi neuronali.
Altri esperimenti hanno mostrato che i livelli della proteina KCNQ2 erano diminuiti di circa il 50% e che i neuroni nella regione CA1 dell’ippocampo mostravano una maggiore eccitabilità, indicando potenzialmente una maggiore suscettibilità alle convulsioni.
In effetti, i topi G256W neonati e quelli più anziani hanno avuto convulsioni spontanee che hanno portato a una mortalità prematura non osservata nei topi di controllo.
“Nel complesso, il nostro studio rivela che la presenza delle varianti KCNQ2 G256W influenza sia gli aspetti molecolari che cellulari dell’attività del canale KCNQ, compresa la loro capacità di trasporto di ioni, l’espressione e il posizionamento all’interno delle cellule”, spiega l’autore senior Edward Cooper, professore associato di neurologia , Neuroscienze e Genetica molecolare e umana presso il Baylor College of Medicine.
“Questi cambiamenti probabilmente si combinano per determinare la patogenicità della variante e i suoi sintomi clinici”.
“I nostri risultati possono essere ampiamente applicabili perché la maggior parte dei pazienti con encefalopatia KCNQ2 condivide varianti vicine al filtro di selettività”, aggiunge Abreo.
I genitori del bambino statunitense, che sono anche coautori dello studio, hanno svolto un ruolo cruciale nello studio per 10 anni, condividendo la loro storia, favorendo il contatto tra medici e scienziati di laboratorio e aiutando il Dr. Cooper a costruire il sistema multi-istituzionale team di laboratorio che ha generato e analizzato i topi.
“Come genitori e leader di una fondazione guidata dai genitori che rappresenta gli impatti globali del KCNQ2, siamo entusiasti di vedere questi studi svelare nuovi misteri del disturbo.
Tali progressi sono la strada verso migliori risultati per i pazienti e terapie di medicina di precisione”, ha affermato Jim Johnson , padre del bambino americano affetto da malattia e presidente della KCNQ2 Cure Alliance*.
Gli autori incoraggiano ulteriori ricerche in quest’area per ampliare i loro risultati. In particolare, evidenziano che, sebbene i topi con la variante G256W mostrino crisi convulsive spontanee e decessi correlati alle crisi, non mostrano l’esordio molto precoce e l’alta frequenza osservati negli esseri umani con la stessa variante.
“Questa differenza merita ulteriori indagini”, hanno scritto. Inoltre, “gli apritori selettivi del KCNQ2, che contrastano gli effetti del G256W in vitro, come mostrato nel nostro studio, dovrebbero essere testati su animali mutanti e, se efficaci, sugli esseri umani con varianti che causano la malattia del KCNQ2”, afferma il dott. Cooper.
Disfunzione dei canali del potassio nell’epilessia genetica
Gli scienziati della Northwestern Medicine hanno scoperto collegamenti funzionali tra dozzine di varianti del gene del canale del potassio e l’epilessia neonatale.
I risultati rappresentano un progresso significativo nella comprensione del gene KCNQ2, secondo Alfred George, Jr., MD, presidente e Alfred Newton Richards Professore di Farmacologia e autore principale dello studio.
KCNQ2 è stato tra i primi geni collegati a forme genetiche di epilessia. Le varianti patogene con perdita di funzione in KCNQ2 compromettono i canali del potassio voltaggio-dipendenti nei neuroni, creando disturbi nella corrente elettrica che regola l’eccitabilità neuronale. Solo una piccola percentuale delle centinaia di varianti KCNQ2 scoperte in pazienti con epilessia è stata valutata funzionalmente, con la maggior parte delle varianti classificate come “varianti di significato incerto” (VUS).
Nel presente studio, George, insieme all’autore principale Carlos G. Vanoye, Ph.D., professore associato di ricerca di farmacologia, ha utilizzato la registrazione patch-clamp ad alto rendimento per misurare gli effetti di 81 varianti KCNQ2 nelle cellule ovariche di criceto cinese.
Queste cellule sono naturalmente prive di KCNQ2, consentendo agli scienziati di introdurre varianti del gene e misurare i cambiamenti nelle correnti passate attraverso i canali del potassio .
“Prima del nostro studio, l’intera letteratura aveva solo circa 50 mutazioni studiate per le loro conseguenze funzionali; noi ne abbiamo studiate 81”, ha detto George, che è anche direttore del Center for Pharmacogenomics. “Ciò aiuta a dimostrare il difetto molecolare con cui queste varianti contribuiscono all’epilessia”.
Secondo George, delle 81 varianti KCNQ2 studiate, quasi 60 erano associate all’epilessia, mentre le restanti sono state trovate raramente in popolazioni sane.
Normalmente, ciascun canale del potassio richiede due copie di geni che codificano per le proteine KCNQ2, e molte delle varianti esaminate erano “dominanti-negative”, compromettendo la funzione anche se accoppiate con un normale gene KCNQ2, avvelenando l’intero canale.
“Molte di queste varianti hanno causato una profonda perdita di funzionalità”, ha detto George.
Un piccolo numero di varianti presentava poche differenze funzionali rispetto al normale KCNQ2, indicando che la loro scoperta nelle persone con epilessia potrebbe essere accidentale o che la disfunzione potrebbe essere presente solo nei neuroni umani.
Per tutte le varianti studiate, George e i suoi collaboratori intendono condividere i risultati con le società di test genetici e aggiornare le voci su ClinVar, un archivio pubblico di varianti genetiche gestito dal National Institutes of Health.
Inoltre, test preclinici hanno suggerito che i pazienti con alcune varianti potrebbero rispondere al trattamento con il farmaco approvato dalla FDA ezogabina, noto anche come retigabina. La somministrazione del farmaco a cellule con varianti patogene ha ripristinato la funzione dei canali del potassio in alcuni, ma l’effetto era molto variabile tra le varianti.
L’ezogabina/retigabina è stata ritirata dal mercato a causa della scarsa diffusione e degli effetti collaterali, ma George ha affermato di ritenere che potrebbe essere uno strumento utile per i pazienti con alcune varianti KCNQ2.
“Ci sono neonati e bambini piccoli con varianti patogene che potrebbero trarne beneficio”, ha detto George.
“Vogliamo collaborare con le aziende farmaceutiche per determinare se la risposta delle varianti della retigabina che abbiamo trovato in laboratorio corrisponde alle risposte cliniche osservate nei pazienti, il che potrebbe aiutare a far avanzare il trattamento di precisione dell’epilessia “.
Nuovo meccanismo alla base dell’epilessia e della modulazione dei farmaci
L’epilessia è un disturbo neurologico che deriva da un’attività elettrica anormale nel cervello che porta a convulsioni. Questi eventi convulsivi possono avere diverse cause, comprese varianti genetiche in una famiglia di proteine che regolano gli ioni potassio nel cervello.
I ricercatori della Washington University di St. Louis hanno guidato un team internazionale per esaminare da vicino i meccanismi alla base della funzione e della disfunzione di queste proteine, nonché le loro interazioni con un farmaco antiepilettico, per sviluppare una potenziale nuova strategia per trattare l’epilessia.
Jianmin Cui, professore di ingegneria biomedica presso la McKelvey School of Engineering, e Nien-Du Yang, uno studente di dottorato in ingegneria biomedica che conduce ricerche nel laboratorio di Cui, hanno collaborato con Harley Kurata, professore associato di farmacologia presso l’Università di Alberta, e hanno studiato il meccanismo di funzionamento di due canali ionici del potassio, KCNQ2 e KCNQ3.
Le loro scoperte svelano un meccanismo conservato per l’attivazione del canale KCNQ che è un bersaglio sia di mutazioni legate all’epilessia che di un composto di piccole molecole.
La famiglia dei canali del potassio KCNQ ha molteplici funzioni, dalla regolazione del battito cardiaco (tramite KCNQ1) al controllo dell’eccitabilità dei neuroni (tramite KCNQ2-5). Questi canali sono attivati dalla tensione in modo che percepiscano i cambiamenti di tensione attraverso la membrana cellulare e si aprano e si chiudano in risposta.
La comunicazione tra il rilevamento della tensione e l’apertura dei pori del canale è nota come accoppiamento elettromeccanico, un processo che coinvolge cambiamenti conformazionali della proteina durante l’attivazione dipendente dalla tensione.
Il team di Cui ha precedentemente dimostrato che KCNQ1, l’isoforma cardiaca KCNQ, presenta un processo in due fasi nell’accoppiamento elettromeccanico che porta a due distinti stati aperti del canale, quello intermedio-aperto e quello attivato-aperto.
La regolazione dei due stati aperti è alla base delle modulazioni tessuto-specifiche, della patogenesi della malattia e della farmacologia di KCNQ1. KCNQ2 e KCNQ3 sono altamente espressi nel sistema nervoso centrale e sono i principali contributori alla corrente M, una corrente critica di potassio che modula l’eccitabilità neuronale nell’epilessia.
Pertanto, la compromissione della funzione della corrente M dovuta a mutazioni congenite in KCNQ2 e KCNQ3 è comunemente associata all’epilessia precoce e pediatrica.
“Sebbene i canali KCNQ siano molto simili nelle loro sequenze e strutture, non è chiaro se anche le isoforme neuronali KCNQ condividano lo stesso meccanismo di accoppiamento elettromeccanico o due stati aperti”, ha affermato Yang, il primo autore dell’articolo sull” epilessia.
“Questo lavoro rivela somiglianze e differenze chiave tra questi canali che potrebbero avere importanti implicazioni per la loro funzione nei cardiomiociti o nei neuroni e per l’epilessia”.
Il team che ha studiato l’epilessia ha utilizzato una varietà di metodi per studiare il meccanismo di accoppiamento elettromeccanico in questi canali del potassio, inclusa la creazione di mutazioni genetiche specifiche nei canali, l’elettrofisiologia e le misurazioni ottiche della fluorescenza.
“Chiarire il meccanismo molecolare dell’accoppiamento elettromeccanico è un passo importante verso la comprensione del gating dipendente dalla tensione dei canali del potassio”, ha affermato Cui.
“Abbiamo fornito prove funzionali che i canali neuronali KCNQ2 e KCNQ3 sono diversi da KCNQ1 in cui presentano un singolo stato attivato-aperto ma con un meccanismo di accoppiamento elettromeccanico conservato specifico per lo stato attivato-aperto.”
Questi canali sono gli obiettivi principali dei trattamenti per l’epilessia, hanno scoperto i ricercatori. Il team ha inoltre identificato una serie di mutazioni in KCNQ2 e KCNQ3 associate all’encefalopatia epilettica infantile precoce, una forma grave di epilessia infantile, che interrompe specificamente l’accoppiamento elettromeccanico dei canali.
I ricercatori hanno sfruttato il prototipo del farmaco antiepilettico retigabina, dato il suo meccanismo d’azione sui canali KCNQ neuronali, e hanno dimostrato che l’accoppiamento elettromeccanico può essere potenziato direttamente per salvare la funzione di questi mutanti malati.
I loro studi sull’epilessia suggeriscono che il meccanismo di accoppiamento elettromeccanico nei canali KCNQ può essere un bersaglio efficace, presentando una nuova strategia farmacologica per lo sviluppo di terapie più efficaci per il trattamento dell’epilessia.